實時熒光定量 PCR
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作者:proef7446
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發(fā)布時間: 2372天前
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實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time Quantitative PCR),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR以其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具,目前已得到廣泛應(yīng)用(如轉(zhuǎn)基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達(dá)、基因分型)。
實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-time Quantitative PCR),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。熒光定量PCR以其特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具,目前已得到廣泛應(yīng)用(如轉(zhuǎn)基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達(dá)、基因分型)。
1. 熒光定量PCR分類
TaqMan 熒光探針
PCR 擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5′-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
SYBR Green熒光染料
SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下,SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光,但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后,熒光大大增強。SYBR Green法價格經(jīng)濟(jì),對于常規(guī)樣本的基因表達(dá)量檢測,具有方便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)點。賽哲擁有的強大引物庫及各類型樣本和基因檢測方案更是為數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性提供了強有力的保證。但由于染料可與所有的雙鏈DNA結(jié)合,其特異性和靈敏度較弱,因此對于一些特殊樣本(如血清樣本)或應(yīng)用(如病毒分型、SNP檢測),則推薦使用探針法。
2. 科研實例
使用探針法檢測某SNP位點
某SNP位點分析結(jié)果
A. 純合(G/G),B. 雜合(G/T)
SNP分型散點圖
SYBR Green 染料法檢測人母乳中 miR-124 在不同時間的表達(dá)水平變化
擴(kuò)增曲線和熔解曲線
miR-124在不同時間的表達(dá)水平變化
3. 服務(wù)內(nèi)容和流程
根據(jù)基因序列設(shè)計擴(kuò)增目的基因以及看家基因的引物;
提取RNA,通過A260/A280測定RNA的濃度和純度;
將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;
實時熒光定量PCR;
數(shù)據(jù)分析,實驗報告整理。
4. 客戶提供
待檢測基因信息;
客戶提供新鮮或凍存的樣本。
5. 百菱生物提供
熒光定量PCR檢測原始數(shù)據(jù);
擴(kuò)增曲線及溶解曲線;
結(jié)果分析。